1 菌落總數及測定

◆菌落是指細菌在固體培養基上生長繁殖而形成的能被肉眼識別的生長物,它是由數以萬計相同的細菌集合而成。當樣品被稀釋到一定程度,與培養基混合,在一定培養條件下,每個能夠生長繁殖的細菌細胞都可以在平板上形成一個可見的菌落。 

◆菌落總數就是指食品檢樣經過處理,在一定條件下(如需氧性質、培養基成分、pH、培養溫度和時間等) 1 mL ( g)檢樣中所含菌落的總數。 

◆菌落總數測定是用來判定食品被細菌污染的程度、食品的新鮮度及衛生質量,它反映食品在生產、加工、銷售過程中是否符合衛生要求,以便對被檢樣品做出適當的衛生學評價。也可以應用這一方法觀察食品中細菌的性質以及細菌在食品中繁殖的動態,菌落總數的多少在一定程度上標志著食品衛生質量的優劣 。

2 菌落總數測定中的注意事項

2.  1 所用器皿及稀釋液 

 ●檢驗中所用玻璃器皿,如培養皿,吸管、試管、移液器的吸頭等必須是完全滅菌的,并在滅菌前徹底洗滌干凈,不得殘留有抑菌物質。 

● 用作樣品稀釋的液體,每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現幾個菌落時,要查找原因,如可通過追加對照平板,以判定是空白稀釋液,用于傾注平皿的培養基,還是平皿、吸管或空氣可能存在的污染。

●檢樣的稀釋液一般用滅菌鹽水,如果對含鹽量較高的食品(如醬品等)進行稀釋,則宜用蒸餾水。做醋時用20% ～ 30%碳酸鈉調pH 至中性。 

 2.2 檢樣的稀釋 

●檢樣稀釋時,應以無菌操作稱取(或量取)有代表性的樣品25 g (或mL ) , 剪碎放于含有225 mL滅菌稀釋液的玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠) ,經充分振搖作成1: 10 的稀釋液。如系肉、魚等固體樣品,先用自來水把表面沖洗干凈,取可食部分(即魚肉)剪細加入稀釋液后,置均質器中以8 000 ～ 10 000 r /min 速度處理1 min,使做成均勻的1: 10稀釋液。 

 ●根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計,將上述1: 10的檢樣稀釋液再做成幾個適當的10 倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,必須另換1 支1 mL 滅菌吸管或吸頭,這樣所得檢樣的稀釋倍數方為準確。 

●從吸管筒內取出滅菌吸管時,不要將吸管尖端觸及其他仍留在容器內的吸管的外露部分;而且吸管在進出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時,也不要觸及瓶口及試管口的外側部分;因為這些部分都可能接觸過手或其他沾污物。當用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9 mL稀釋液的試管內時,應小心沿管壁加入,不要觸及管內稀釋液,以防吸管尖端外側部分黏附的檢液也混入其中。 

●對吸管體積的要求是取1 mL的樣品勻液使用的吸管的最小刻度應該不低于0. 1 mL。

2. 3 平板接種與培養 

●在作10倍遞增稀釋的同時,即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(從皿側加入,不要揭去皿蓋) ,最后將吸管直立使液體流畢,并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出,而不要吹出。每個稀釋度應作2 個平皿。 

● 用于傾注平皿的營養瓊脂應預先加熱使其融化,并保溫于( 45 ±1) ℃恒溫水浴中待用。溫度太高影響細菌生長,太低瓊脂易凝固不能與檢液充分混勻, 傾注平皿時, 每皿內傾入約15 mL,平板過厚可影響觀察,太薄又易干裂,最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。

※為了防止細菌增殖及產生片狀菌落,在檢液加入平皿后,應盡 快傾注培養基并旋轉混勻,可正反兩個方向旋轉,檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20 min。瓊脂凝固后,在數分鐘內即應將平皿翻轉予以培養,這樣可避免菌落蔓延生長。

●為了控制污染,需做空白對照實驗,在取樣進行檢驗的同時,于工作臺上打開一塊瓊脂平板,其暴露的時間,應與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長的時間相當,然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內培養,以了解檢樣在檢驗操作過程中有無受到來自空氣的污染。 

●培養溫度,應根據食品種類而定。一般用36 ℃培養,培養溫度和時間有不同的區分,是因為在制定這些食品衛生標準中關于菌落總數的規定時,分別采用了不同的溫度和培養時間所取得的數據,同時水產品因來自淡水或海水,水的溫度較低,因而制定水產品細菌方面的衛生標準時,系用30 ℃作為培養的溫度 。 

● 加入平皿內的檢樣稀釋液(特別是10- 1的稀釋液) ,有時帶有食品顆粒,在這種情況下,為了避免與細菌菌落發生混淆,可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿,不經培養,而于4 ℃環境中放置,以便在計數檢樣菌落時用作對照。

2.  4 菌落記數與報告 

● 到達規定培養時間,應立即計數。如果不能立即計數,應將平板放置于0～4 ℃,但不得超過24 h。從溫箱內取出平皿進行菌落計數時,應先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內平板上菌落生長情況。

平行試驗的2 個平板與菌落數應該接近,不同稀釋度的幾個平板上菌落數則應與檢樣稀釋倍數成反比,即檢樣稀釋倍數越大,菌落數越低,稀釋倍數越小,菌落數越高。如果稀釋度大的平板上菌落數反比稀釋度小的平板上菌落數高,則系檢驗工作中發生的差錯,屬實驗室事故。此外,也可能因抑菌劑混入樣品中所致,均不可用作檢樣計數報告的依據。 

●如果平板上出現鏈狀菌落,菌落之間沒有明顯的界限,這是在瓊脂與檢樣混合時,一個細菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計不要把鏈上生長的各個菌落分開來數。 

●檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料) ,則平板計數中應相應地將有關微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除,不可并入檢樣的菌落總數內作報告。一般在校正檢樣的pH 7. 6后,再進行稀釋和培養,此類嗜酸性微生物往往即不易生長。

●當檢樣的菌落數為1～100 時,按實有數報告;大于100時,只記錄左面頭兩位數字(用兩位有效數字作報告,可避免產生虛假的精確概念) ,左面第三位數字則用四舍五入法計算,從第二位數字之后都記為0,為了縮短數字后面的0數,也可用10 的指數來表示,固體檢樣以克( g)為單位報告,液體檢樣以毫升(mL)為單位報告,表面涂擦則以平方厘米( cm2 )報告。

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